Séquence 1 : Définitions. Génétique classique: transmission de l'information génétique d'une génération à l'autre.

A l'aube des années 1970, bien que les bases de l'expression des gènes soit de mieux en mieux comprises, on ne sait pas les isoler pour en faire une étude approfondie. Un pas décisif sur le plan technique va permettre de mettre au point les "outils du génie génétique".

4.1 LA BIOLOGIE DEVIENT OPERATOIRE:

Les enzymes de restriction sont produites par les bactéries lorsqu'elles sont infectées par un bactériophage. Mais, contrairement aux DNases connues jusque là, qui coupent l'ADN au hasard, les DNases de restriction sont capables de couper l'ADN en des sites déterminés: elles reconnaissent une séquence de bases et coupent l'ADN chaque fois qu'elles la rencontrent.

Les chercheurs disposent à l'heure actuelle de plusieurs centaines de telles enzymes, véritables "ciseaux moléculaires" (Eco Ri, Hind III, Taq I...) reconnaissant des séquences de bases spécifiques et engendrant des fragments d'ADN dont les extrémités forment de véritables "bouts collants".

Cette propriété en fait des outils de choix permettant de découper l'ADN pratiquement où l'on veut non seulement pour isoler des gènes, mais aussi pour les insérer dans des phages ou des plasmides qui se révélèrent d'excellents vecteurs pour multiplier des gènes étrangers.

L'hybridation de deux molécules d'ADN provenant de deux espèces différentes nécessite la soudure des fragments obtenus après action des enzymes de restriction. Une enzyme, l'ADN ligase, facilite la réassociation des "bouts collants" par le biais de la complémentarité de leurs bases.

L'ARN polymérase est un complexe enzymatique qui assure plusieurs fonctions:
- reconnaissance sur l'ADN des signaux génétiques qui permettent de commencer et de terminer la synthèse d'ARNm en des sites précis,
- ouverture de la molécule d'ADN au niveau des liaisons labiles qui unissent les deux brins,
- polymérisation des nucléotides dans un ordre imposé par la complémentarité des bases des nucléotides de l'ARN et de celles des nucléotides d'une des deux chaînes transcrites de l'ADN.

En 1970, Howard Martin TEMIN et David BALTIMORE isolent, à partir de virus, la transcriptase inverse, une enzyme capable de réaliser l'opération inverse de celle de l'ARN polymérase, qui permet d'obtenir de l'ADN à partir de l'ARN. Ils seront récompensés par le Nobel en 1975 avec Renato DULBECCO.

Son utilisation rend possible la synthèse d'un gène à partir de l'ARNm gouvernant l'assemblage d'une protéine. On obtient d'abord une copie d'ADN simple brin, puis à l'aide d'autres enzymes spécifiques, une copie double brin d'ADN complémentaire (ADNc).
L'hybridation ultérieure de ce gène avec un autre ADN exige la formation de nouveaux "bouts collants" à chacune de ses extrémités.

4.2 PRINCIPE D'ETABLISSEMENT D'UNE CARTE DE RESTRICTION:

Cet exercice, purement méthodologique, vise à vous entraîner à tirer des conclusions par analyse logique d'un ensemble de données expérimentales. L'objectif est de rechercher les positions relatives des sites de coupures par deux enzymes de restriction sur un échantillon d'ADN de longueur 5 000 pb (paires de bases).
A - Les chercheurs disposent de nombreux exemplaires d'un échantillon d'ADN, obtenus par clonage de l'échantillon initial. Ce matériel est divisé en deux lots équivalents et chaque lot est soumis à l'action d'une enzyme de restriction, l'enzyme A pour un lot, l'enzyme B pour l'autre lot.

On rappelle qu'une enzyme de restriction coupe l'ADN chaque fois qu'elle rencontre un site précis, différent d'une enzyme à l'autre. L'attaque enzymatique est conduite de façon telle que tous les sites spécifiques de l'enzyme A pour un lot, de l'enzyme B pour l'autre lot, sont coupés.
Chaque lot d'ADN est alors soumis à une électrophorèse qui sépare les fragments d'ADN obtenus selon leur taille. Une électrophorèse témoin consistant à séparer des fragments d'ADN de taille connue permet de disposer d'une échelle des tailles (exprimée ici en paires de bases). Les résultats de ces premières électrophorèses sont présentés sur le document ci-contre.

1° Combien l'échantillon d'ADN initial présentait-il de sites de coupure pour l'enzyme A ? pour l'enzyme B ?
2° Montrez à l'aide de schémas simples qu'il n'est pas possible de reconstituer avec certitude la disposition relative des fragments obtenus par l'action d'une enzyme de restriction (A ou B).

B - Chaque ensemble de fragments obtenus par action de l'enzyme A est alors isolé et traité par l'enzyme B. Dans chaque cas, une nouvelle électrophorèse sépare les fragments éventuellement obtenus.

La même opération est réalisée pour les fragments obtenus au départ par l'action de l'enzyme B qui sont soumis à l'action de l'enzyme A. Les résultats de ces électrophorèses sont présentés sur le document ci-contre.

1° Comparez le résultat de l'action

- de A sur le fragment de 2 500 pb découpé par B ;
- de B sur le fragment de 2 100 pb découpé par A.

Illustrez par un schéma la conclusion se dégageant de cette comparaison.
2° Poursuivez cette comparaison méthodique de couples de fragments convenablement choisis et proposez une "carte" montrant les positions relatives des sites de coupure pour A et B sur l'échantillon d'ADN initial.

La combinaison de l'électrophorèse et de l'hybridation de sondes a permis de repérer la présence d'une séquence précise dans l'ADN. La technique a été mise au point par E.M. SOUTHERN (1975):

        l'ADN est traité par une enzyme de restriction: plusieurs milliers de fragments de tailles différentes sont ainsi produits.

        le mélange est disposé dans un puits d'une plaque de gel d'agarose et soumis à une électrophorèse qui provoque la migration des fragments, d'autant plus vite qu'ils sont petits.

        après dénaturation de l'ADN (séparation des brins complémentaires), la plaque est mise au contact d'un filtre de nitrocellulose qui recueille une empreinte ("blot") du gel.

        le filtre est immergé dans une solution contenant une sonde moléculaire radioactive (fragment d'ADN reconnaissant une séquence du génome) pendant quelques heures à 65°C: celle-ci se fixe sur les fragments complémentaires. Le filtre est ensuite rincé pour éliminer les sondes non fixées.

        on procède à la révélation de l'emplacement de la sonde et donc des fragments complémentaires par une technique appropriée : autoradiographie pour les sondes radioactives, photographie pour les sondes fluorescentes, réactions enzymatiques pour les ligands reconnus par des protéines spécifiques.

6.1 LE MORCELAGE DU GENE DES EUCARYOTES

Le gène de l'ovalbumine: les travaux de P.CHAMBON (1977)

Le document ci-contre traduit le résultat d'une expérience d'hybridation au cours de laquelle le brin d'ADN codant pour l'ovalbumine a été mis en présence de l'ARN messager qui, dans le cytoplasme, dirige la synthèse de cette protéine. Les nucléotides appartenant aux séquences complémentaires de l'ADN et de l'ARN vont se reconnaître et s'accoler par leurs bases.

Décrivez ce que vous observez et tirez-en une conclusion quant au mode d'expression d'un gène d'eucaryote par rapport à celui d'un procaryote. Proposez un schéma pour illustrer cette différence.

On appelle introns les séquences d'ADN transcrites, puis excisées lors de la maturation de l'ARNpm (ARN prémessager). Les séquences d'ADN transcrites en ARNpm et conservées dans l'ARNm après excision sont appelées exons.

La découverte d'introns et d'exons dans les gènes d'eucaryotes introduit ainsi un nouveau concept de gène: celui de gène morcelé, qui va conduire à réviser le dogme "un gène -> une protéine".

6.2 CONSEQUENCE DU MORCELLEMENT DES GENES

Les exons d'un ARN pré-messager ne sont pas toujours épissés de la même manière: ceci va donner naissance à des ARN messagers différents, donc à des protéines différentes (épissage alternatif). Un même gène peut ainsi gouverner la synthèse de protéines différentes: c'est le cas du gène de la calcitonine.

L'hormone CALCITONINE est une hormone produite et sécrétée par des cellules thyroïdiennes.

L'hormone CGRP (Calcitonine Gene Related Protéine) est un neuropeptide produit par certaines cellules de l'hypophyse.

Dans des cellules thyroïdiennes, l'ARNpm est découpé et polyadénylé au 1er site. L'excision de 3 introns et l'épissage des 4 exons restants produisent l'ARNm codant pour un précurseur de la calcitonine.
Dans des cellules hypophysaires, le même ARNpm est découpé au 2e site. Après excision de 4 introns, de l'exon 4 et épissage de 5 exons, l'ARNm obtenu code pour le précurseur du CGRP.

On estime que plus de 40% des gènes humains sont l'objet d'un épissage alternatif: ceci confère au génome une possibilité de synthèse de protéines bien supérieure au nombre de gènes. C'est ce que nous constaterons pour expliquer la grande variété des anticorps que l'organisme est capable de produire, eu égard aux 30 à 40 000 gènes du génome humain.

7.1 LA TRANSGENESE

Le génie génétique permet d'introduire dans une cellule un gène qu'elle ne détient pas. Dans son environnement antérieur ce gène s'exprime habituellement, c'est-à-dire qu'il code pour la synthèse d'une protéine.

Il est possible également de supprimer ou de modifier l'expression d'un gène déjà présent dans le génome d'une cellule.

Le génie génétique peut s'appliquer aux végétaux, aux animaux, à l'homme, aux micro-organismes.

Une plante transgénique est une plante dont le génome a été modifié par l'introduction d'un gène qui peut provenir d'une autre plante, d'une bactérie ou de tout autre organisme. Ce gène peut coder une enzyme qui intervient dans la maturation des fruits, une substance qui bloque la multiplication d'un virus, une nouvelle protéine, par exemple un composé toxique pour les insectes ravageurs, ... C'est ce dernier exemple que nous exposerons.

7.1.1 Qu'entend-on par OGM?

Il est nécessaire de faire cette précision afin de conduire le débat que nous pourrons avoir pour répondre aux inquiétudes que ces OGM suscitent.

Un OGM (Organisme Génétiquement Modifié) est un organisme vivant dont le génome a été modifié par génie génétique. Toutes les cellules de cet organisme possèdent le gène étranger: cette modification génétique est donc transmissible à sa descendance par le biais de toutes ses parties capables de donner une nouvelle plante (fruits, graines, organes de reproduction végétative).

Les produits dérivés des OGM, n'ayant aucune capacité de reproduction, ne sont pas des OGM, même s'ils peuvent éventuellement contenir le gène introduit ou la protéine codée par ce gène.
Ainsi, des plants de colza transgénique résistant à un champignon pathogène sont des OGM, leurs graines aussi.

En revanche, l'huile de colza destinée à l'alimentation de l'homme ou le tourteau de colza destiné à l'alimentation animale, ne sont pas des OGM, mais des produits dérivés d'un OGM.

Compte tenu des procédés de fabrication, il est très probable que la plupart des huiles raffinées que nous consommons ne contiennnent pas de protéines ou d'ADN.

Le tourteau, obtenu à partir des résidus de fabrication de l'huile, contient des protéines et de l'ADN. Il peut donc contenir le gène de résistance au champignon pathogène et la protéine codée par ce gène.

7.1.2 Comment obtient-on une plante transgénique?

Après avoir repéré un caractère intéressant dans un autre organisme vivant (plante, champignon, bactérie...) et identifié la protéine responsable de ce caractère, on identifie et on isole le gène codant cette protéine.

On réalise une "construction génique" qui contient le gène d'intérêt et des séquences d'ADN (promoteur, terminateur) indispensables à son fonctionnement dans le génome d'une cellule végétale. Ces séquences sont impliquées dans la régulation de l'expression du gène. Elles permettent de cibler le lieu d'expression du gène dans la plante (graines, racines, feuilles...), voire de faire en sorte qu'il ne s'exprime qu'au moment nécessaire, lors de l'attaque d'un insecte ou de l'infection par un virus par exemple. Cette construction contient éventuellement un gène marqueur de repérage des plantes transgéniques (par exemple un gène de résistance à un antibiotique: voir ci-dessus § 5.1.2). Cette construction génique est ensuite insérée dans un plasmide bactérien pour être multipliée.

On introduit la construction génique dans le génome de la cellule végétale par deux méthodes:

o       transfert biologique: au moyen d'un vecteur, la bactérie du sol Agrobacterium tumefaciens, qui transfère naturellement une partie de son ADN (auquel on a donc ajouté la construction génique à intégrer) dans le génome des plantes.

o       transfert mécanique: les constructions géniques, portées par des microbilles de tungstène, sont projetées dans la cellule végétale.

On sélectionne les cellules exprimant le gène ajouté.

On régénère des plantes entières à partir de ces cellules. Ces plantes sont testées en serre puis en champ afin de vérifier la conformité de leur développement, la stabilité de l'expression du gène ajouté, sa transmission à la descendance.

7.2 UN EXEMPLE D'ORGANISME VEGETAL GENETIQUEMENT MODIFIE POUR LA RESISTANCE AUX INSECTES